什么是香菇的扩大培养？

一、什么是香菇的扩大培养？

答:自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。

(一)母种的分离培养

食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。

1.孢子分离法

孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。

(l)单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，

让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。

(2)多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种：

①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面;上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印(平菇极淡紫色，蘑菇、草菇

为褐色，香菇、金针菇孢子印白色)。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。

还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入

20℃左右恒温箱培养。

②褶上涂抹法：按无菌操作分离时;应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。

③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片(黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝(或铁丝、棉线等其他悬挂材料)悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。

④贴附法：按无菌操作将成熟的菌褶或耳片取一小块，

用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经6～12小时的培养，待孢子落在斜面上，立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。

孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮，当母种定植一星期左右，菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管，进而转管扩大，一般到栽培种，转管不宜超过5次。

孢子分离得到的母种，必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。

一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分离法获得母种。

现就银耳孢子分离略述于下：

按无菌操作获取种耳后，悬挂种耳的三角瓶经12小时培养后，瓶底培养基表面就有"孢子印"。取出种耳，置

20℃—25℃温箱培养2～3天，培养基表面会出现乳白色透明的糊状小菌落，就是银耳的酵母状分生孢子形成的少量银耳菌丝。此时移接入试管斜面培养基上，待长满斜面后，再移接入营养丰富，且表面比较干燥的培养基上。经30天左右，菌落长出白色菌丝。

银耳的酵母状分生孢子、菌丝只有与羽毛状菌丝的子囊菌(香灰菌丝)混合培养时，由后者帮助分解木材及其他一些纤维物质，提供营养，才能利于银耳孢子萌发，菌丝的定植和子实体的形成。

在两种菌丝交会时，先选出两种纯菌丝。

羽毛状菌丝要纯化选育，一般要选取生长迅速，爬壁力强的试管斜面或种瓶，取先端菌丝，转管移接，置25℃—28℃上培养，重复转管几次即可得到优良纯种。

银耳菌丝的特点，菌丝生长缓慢，担孢子也不易萌发。在进行两菌混合时，先取经8～IO天培养的银耳菌丝斜面，按无菌操作方法在该斜面上距银耳菌丝约0.5厘米处接入一

小块羽毛状菌丝。置25℃下培养1周即得到混合好的银耳母种。

2.组织分离培养法

利用子实体内部组织，进行无性繁殖而获得母种的简便方法，即组织分离。该法操作简便，菌丝生长发育快，品种特性易保存下来，特别是杂交育种后，优良菌株用组织分离法能使遗传特性稳定下来。常采用以下分离方法。

(l)子实体分离：种菇要选朵大盖厚，柄短，八九分成熟的优良品种。切去菇两基部，在无菌箱内以0.1%的升汞水浸几分钟，再用无菌水冲洗并揩干或用75%酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次，进行表面消毒。接种时，只要将种菇撕开，在萌盖和菌柄交界处或菌褶处，挑取一小块组织;移接

到PDA培养基上。置25℃左右温度下培养3-5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。如香菇、平菇等可以用此方法。

(2)菌核分离：茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不易采集。而常见的是它贮藏营养的菌核。用菌核分离，同样可以获得菌种。方法是将菌核表面洗净，用酒精或升汞消毒后，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA

培养基斜面上，保温培养。应注意的是，菌核是贮藏器官，大部分是多糖类物质，只含有少量的菌丝，因此挑取的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分出菌种。

(3)菌素分离：有一部分子实体不易找到，也没有菌核，可以用菌素进行分离。如蜜环菌、假蜜环菌。其操作方法是先用酒精或升汞将菌素表面黑色皮层轻轻擦拭2～3次，

然后去掉黑色外皮层(菌鞘)，抽出白色菌髓部分;用无菌剪刀将菌髓剪一小段，接种在培养基上，保温培养，即得该菌菌种。

菌素分离要注意：因菌素比较细小，分离素也比较细小，分离时极易污染杂菌，所以要严格操作。

3.基内菌丝分离培养法

利用食用菌生育的基质作为分离材料，来得到纯菌种的一种方法，叫基内菌丝分离法。

此种分离方法是适宜只有在特定的季节才出现，而且是朝生暮死，不易采得的子实体。基内分离法与组织分离法不同之点是，干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。接种后有时并不立刻恢复生长。因此，有必要保留较长的时间(约1个月)，以断定菌丝是否能成活。基内菌丝分离法又可分为，材中菌丝分离(即菇木或耳木分离法)及土中菌丝分离法等。

(1)材中菌丝分离法：就是菇木或耳木分离法，为了减少杂菌的感染，菇(耳)木在分离之前，必须进行无菌处理。可以把菇(耳)水表面用酒精灯火焰轻轻烧过，以烧死霉菌的孢子，或再用0.1%的升汞水浸孢几分钟，然后用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干。接种块切取时应注意。接种块必须在该菌菌丝分布的范围内切取。所以，菌丝生长缓慢的种类应浅取;菌种生长快的种类可以深取。同时。还应根据菇菌的种类、木材质地、菇(耳)木粗细、发育时间的长短来确定菌丝分布的范围。然后用一把利刀进行切取。接种块应尽量小些，以减少杂菌感染机会，提离菌种的纯度。接种块移到培养基上，就应该放到适合菌丝生长的22℃～26℃

的温室或温箱中培养，使菌丝恢复生长。

(2)土中菌丝分离：食用菌种类很多，许多土生的食用菌;孢子不易萌发。组织分离也不易成功，用土中菌丝分离获得纯种的方法，叫土中菌丝分离。

土中菌丝分离时要注意，由于土中菌丝体的周围生活着多种多样的土壤微生物，因此分离时必须尽可能避开这些微生物的干扰，尽可能批取清洁菌丝素的尖端、不带杂物的菌丝接种，反复用无菌水冲洗，在培养基中加入一些抑制细菌

生长的药物，如

40微克/升的链霉素或金霉素。如发现感染细菌，可以把菌落边缘的菌丝挑出来，接种到木屑培养基中。因细菌没有分解木质素的能力，因此在木屑培养基中不易扩展;只局限于接种处。待菌丝长出感染区后，就可以再进行扩大提纯了。

(3)子实体基部分离：从瓶栽、袋栽或大床栽培的子实体基部分离出新菌丝的方法，叫子实体基部分离，现以袋栽银耳为例说明：

从出耳早、出耳率离、无病虫害的栽培室中;选择生活力最强的幼耳5袋，移到气候温和，有散射光的野外场所进行后期培养，以增强菌丝体的生活力。经培养7～10天后，待子实体直径达4～5厘米时便可取回，作为分离的母体。再从中筛选最理想的一朵，用利刀割掉银耳子实体，放置于

0℃的冰箱或有敌敌畏的容器中过夜，以便杀死瓶中的害虫。然后用75%酒精或升汞擦洗耳基和袋子外边的杂质，连同接种工具、接种培养基等移进无菌室。经灭菌后，用接种刀把袋口上部约15毫米厚的老菌根挖除，并进行培养。待袋口露出白色菌丝时，用接种针挑取一块半粒米大的白色菌结体，迅速移入母种试管培养基的中央，轻轻地脱去接种针，

塞上棉塞。

为了能够获得较多的母种，一次接种量要有100—200支试管，以便从中选择。分离后应及时移入22℃—24℃恒温箱或温室中培养。由于培养基内水分较多，菌丝恢复要比耳木分离得快。经2-3天后，分离物的边缘就可看

到白色菌丝。每天要至少观察两次，以便提纯。观察、提纯方法与耳木分离法担同。经适温培养10-15天后，当接种块扭结团出现红、黄色水珠时，即可扩大原种。

(二)原种和栽培种的接种培养

母种获得以后，为了满足菌种生产的需要。应选出优良、纯度高的母种进一步扩大为原种。

原种培养基一般采用棉籽壳、木屑、草类等培养基。

瓶装或袋装的原种培养基灭菌后，可送入灭过菌的接种箱内，待瓶中的培养基冷至30℃以下，可按照无菌操作程序进行接种。

菌种瓶(袋)放入培养室时，要经常进行检查，一经发现杂菌污染，立即取出。培养成的原种，菌丝体必须健壮有力，紧贴瓶壁而不干缩，颜色纯正，具有一定清香味，生活力强，扩制成栽培种时吃料快。

栽培种就是将原种进一步扩大培养成三级种，它和原种的接种及培养相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴头、木耳、银耳的栽培种多用锯木、棉皮作培养基。蘑菇多用粪草做培养料。

栽培种要求料块不脱水干缩。菌丝体健壮有力、颜色纯正，有清香味，无老化现象，无杂菌污染，有的种许可有少量原基，接入栽培料后，发菌快，长势好，生活力强。

原种在接栽培种时，原种瓶口的一层菌丝体应挖去不用。

(三)液体种的简单培养

目前，用液体深层发酵法生产菌种，具有生产量大、周期短、菌龄整齐、成本低廉、接种方便等特点，是实现食用菌工厂化生产的目标。现将液体种培育过程简述于后，供参考。

简言之就是将纯正优良的菌种，接入液体培养基(固体培养基不加凝固剂)，使菌丝繁殖形成大量小菌球，然后将这种培养基拌入木屑或棉籽皮料内，制成菌块、培养其形成子实体。还可用于制原种、栽培种。

培养液体菌种，可将培养液装入三角瓶中，约占空瓶的五分之一重量。用摇瓶机(也称摇床)来培养。摇瓶机有旋转式和往复式两种，一般多用往复式。液体培养基可用马铃薯汁(加糖)，麦芽汁配制，也可用玉米粉、豆饼粉、糖、无机盐等配制。可以混合培养基，因适用于多种食用菌和药用菌的培养，均有好效果。组分：豆饼粉2%，玉米粉1%，

葡萄糖3%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙 0.2%， pH自然， 12℃灭菌半小时。然后接种培养。

如果生产量较大，在三角瓶的基础上，再逐级扩大种子缸，发酵罐中进行液体深层通气发酵，产生大量菌种。但由于生产中要求设备繁多，技术性强，我们还应创造条件;实现食用菌栽培的现代化。

(四)菌种质量的鉴定

菌种质量鉴定最好的方法是，做出菇试验。但是时间比较长。在购置菌种时，或在菌种生产中，如何能知菌丝生长情况，快速判断菌种质量?我们介绍几种方法：

1.肉眼观察：优良菌种菌丝浓白，绒状，粗壮密集，生长整齐，速度快，香味浓厚。

2.优良菌种标准可归纳为："纯、香、正、壮、润"五个字。检查时，打开瓶塞，从菌种瓶中部取出小块菌丝体，观察色泽，闻其气味，手捏料块检查其含水量，看是否符合上述要求标准。

3.显微镜检查：挑取少量菌丝，置显微镜上观察其形态，菌丝分枝，分隔情况，锁状联合，细胞膜的厚薄。

培养观察：从菌种瓶中挑取小块菌丝体，接种斜面试管培养基上，置23℃～25℃恒温中培养，经五周后检查菌种生活力。如果菌丝生长快，旺盛纯一，健壮浓厚，长且整齐，则表示菌种的生活力强。

4.分块法：在桌上放一张白纸，把菌龄相同的菌种从瓶内取出一大块，用手分成2块，再把2块分成4块，4块

分成8块，依次进行。优良菌种整块多，碎渣少。劣次菌整块少，碎渣多。

5.液体菌种鉴别：当三角瓶或发酵缸培养3-7天后，如液面出现气泡，产生"油皮"、混浊等现象，说明菌种本

身带有杂菌。如菌块上浮，或迟迟长出很薄的菌丝层，则说明菌种生活力弱。白块四周的菌丝生长快、浓白、棉絮状，表明菌种生命力强。

(五)菌种生产过程中的杂茵防治

在生产菌种时，要时刻注意杂菌污染，以防为主，一旦发生，根治很不容易。所以整个制种过程都必须在无菌条件下进行。接种箱及所有分离、接种的用具、器皿，都要进行严格的消毒灭菌。工作人员的双手要用消毒剂清洗，并穿戴消过毒的工作服、帽和口罩，动作要敏捷、准确，尽量不要讲话走动，以防空气中的杂菌感染。

分离母种时，选择出菇早、生活力强，第一潮菇是关键，因它生活力强，接种后迅速占领阵地，无杂菌侵入的机会。

被污染的菌种，原因是多方面的，一般是灭菌不彻底所致，或因接种时无菌操作不严、瓶盖不合适造成的。所以灭菌一定要彻底，最好在接种萌将培养基置25℃左右温箱中做效果检查，经2天不长杂菌，说明彻底，可以使用，接种过程中一定要严格无菌操作。

污染杂菌另一个原因可能是分离母种时感染杂菌，因种菇表面带菌，消毒不彻底，通过组织块将杂菌带入培养基。

总之，污染机会很多，要注意环境消毒，按无菌操作规程彻底灭菌，层层把关，环环抓紧，严加注意;提离菌种质量。

二、酵母菌扩大培养的意义？

酵母菌是单细胞真菌生物，具有很高的营养价值，特别是含有较多蛋白质、B族维生素、核酸和矿物质，同时也能产生一些保健功能活性物。因酵母属于简单的单细胞真核生物，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。是遗传工程研究过程中常用的受体菌种。从自然界或商品中分离纯的酵母菌株，通常采用平板或斜面涂布划线法。这两种方法简单有效，是实验室分离纯化菌种常用到的方法。

在发酵过程中定时地取样测定，包括对菌体进行镜检、测定不同时期发酵液的菌体浓度、残留的还原糖等参数，动态地了解发酵过程中过程变量的变化，分析菌体生长、基质消耗、产物生成的速度，研究发酵动力学，为生产中优化培养条件提供数据依据。

三、菌种扩大培养的目的是什么？

菌种扩大培养的目的是，

菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关,接种量大,发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中,就有利于缩短发酵时间,提高发酵罐的利用率,并且也有利于减少染菌的机会。因此,种子扩大培养的任务,不但要得到纯而壮的菌体,而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的菌体。

四、什么是菌种扩大培养的主要设备？

菌种扩大培养法是对保藏菌种进行活化和逐级繁殖培养，从而为发酵生产提供相当数量代谢旺盛并满足一定生理要求的微生物细胞(种子)的方法。

现代的发酵工业生产规模越来越大，发酵罐的容积一般都在几十至几百立方米，有的甚至可达数千立方米。要使微生物在较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，必须具备相当数量的微生物细胞。因此菌种的扩大培养(工业上又称种子制备)是任何发酵生产过程都不可或缺的重要环节。

五、为什么选择大肠杆菌和啤酒酵母作为液体培养的菌种？

因为这两种菌的生长力旺盛，不易死亡

六、为需氧菌培养的气体条件为？

需氧菌培养的气体条件是氧气充足，需充气泵不断充入氧气

七、确立种子扩大培养的级数要考虑哪些因素？

种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。

种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。

这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。

菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序又称之为种子制备。种子制备不仅要使菌体数量增加，更重要的是经过种子制备培养出具有高质量的生产种子供发酵生产使用。

工业微生物的扩大培养

1、种子扩大培养的任务：得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。

对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数。

抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常采用三级种子扩大培养；

一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的也采用四级发酵如链霉素生产；

有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵；

谷氨酸及其他氨基酸的发酵所采用的菌种生产繁殖速度很快，常采用二级发酵。

2、种子制备的过程

种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的制备过程和在液体培养基中生产大量菌丝或营养体的种子制备过程。

（1） 孢子制备

孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。

不同菌种的孢子制备工艺有不同的特点，包括：放线菌孢子的制备；霉菌孢子的制备；细菌培养物的制备。

（2） 种子制备

种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。种子制备所使用的培养基和其他工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。

1）摇瓶种子制备

某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。

常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的培养基配方。

2）种子罐种子制备

种子罐种子制备的工艺过程因菌种不同而异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。

八、怎么进行实验室乳酸菌的扩大培养？

平板培养的微生物会长成菌落啊，就是一个一个的点。在超净台里面用接种环从平板里面挑几个菌落，放到含有液体培养基的试管里面先进行小规模培养，等菌长起来之后再吸一部分菌液到有液体培养基的锥形瓶里扩大培养。分级扩大培养是为了获得纯菌株，每个菌落的细菌都是由同一个细菌分裂繁殖出来的。它们的遗传物质基本上一样。而不同菌落的细菌则有可能因为在平板培养之前的步骤（如质粒的重组及转化）而导致遗传物质有所差异。如质粒重组时对DNA有所损伤的话，质粒转染后DNA被酶修复时有可能出错。

所以需要使用同一个菌落的细菌来做后续实验，以确保菌株遗传物质的同一性。

九、丝状真菌发酵种子扩大需要什么样的培养基和培养条件？

真菌发酵种子扩大需要疏松的基质，潮湿的环境

十、以扩大内需为战略基点的理由？

1.消费对生产具有反作用，扩大内需能够拉动经济的发展。2.把扩大内需作为经济发展的战略容基点，有利于我国实现经济发展方式转变，由依靠投资、出口拉动经济增长转变为依靠出口、投资、消费协调拉动经济增长。3.符合当前的我国国情，当前世界经济形势严峻，我国出口压力增大，必须立足自身、扩大内需，才能保证经济的平稳运行，最大限度消除不利影响。

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